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① 于20ml 營(yíng)養(yǎng)肉湯中過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)菌，37℃，200rpm。

② 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)10000g、20min、4℃離心，去上清。

③ 20ml預(yù)冷的Tris-Mg緩沖液重懸，同樣條件離心，再重懸于預(yù)冷的Tris-Mg緩沖液。

④ 超聲波破碎細(xì)菌。

⑤ 3000g，10min、室溫下離心去除未破碎細(xì)菌。小心吸取上清（含有胞質(zhì)成分和細(xì)菌外被成分）。

⑥ 超速離心I：100,000g，60min，4℃，去除上清（胞質(zhì)成分），收集細(xì)菌外被成分。

⑦ 用10ml含2％的SLS的Tris-Mg 緩沖液重懸沉淀物，室溫溫育20-30min。

⑧ 超速離心II：70,000g，60min，室溫沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含細(xì)胞質(zhì)膜）。重復(fù)⑦、⑧兩步。

⑨ 充分吸除上清，并根據(jù)沉淀體積大小用0.1-0.2 ml的ddH2O重懸沉淀物。根據(jù)公式：蛋白濃度(mg/ml)=1.450 D280-0.740 D260測(cè)定外膜蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度至40ug/ul，該蛋白質(zhì)樣品-70℃貯存。

試劑

① Tris-Mg 緩沖液
10mM Tris-Cl
5mM MgCl2
pH 7.3，4℃保存

② 2%(w/v)十二烷基肌氨酸鈉 (SLS)